equipo Enzima-ligado del análisis del inmunosorbente (ELISA) para Enterokinase recombinante

REK ELISA Kit

uso 1.Intended

Este equipo de ELISA se piensa para el uso en la cuantificación de Enterokinase, recombinante del páncreas bovino. El equipo está para el uso de la investigación solamente y no se piensa para el uso de diagnóstico en ser humano o animales.

parámetros 2.Basic de ELISA Kit

≤ 1 ng/ml de la sensibilidad

Gama de la detección: 0,25 -16 ng/ml

Especificidad: El enterokinase bovino recombinante se puede detectar sin reactividad cruzada significativa con otras proteínas relacionadas al sistema de la expresión recombinante del coliforme.

Repetibilidad: Los coeficientes de variación entre las placas y en una sola placa son ambos menos el de 10%

Tiempo de funcionamiento: Los experimentadores expertos pueden terminar una determinación en 2,5 horas.

Vida útil: 6 meses

composición 3.Kit y almacenamiento

Los equipos cerrados se pueden almacenar en el °C 2-8 para una semana. Si el equipo es utilizado después de una semana, desmonte el equipo y almacene cada componente por separado según las condiciones en la tabla abajo.

Explicación:

1. Todas las cápsulas reactivo deben ser apretadas atornillado para prevenir la evaporación y la contaminación microbiana.

2. La placa de microtítulo se puede almacenar en el °C -20 por 6 meses, y no almacenar en el °C 2-8 para más de una semana.

4.Self proporcionó el equipo experimental

1. Lector de Microplate (longitud de onda 450 nanómetro y 650 nanómetro del filtro)

2. Pipeta de la alta precisión, tubo del EP y extremidades disponibles

3. incubadora de 37 °C, agua destilada doble o agua desionizada

4. papel absorbente

5.Note para que muestras sean probadas

1. Si la muestra se prueba en el plazo de 1 semana después de la colección, puede ser almacenada en 2-8 °C. Si no puede ser detectada a tiempo, distribúyala por favor según el periodo utilizó una vez y almacenarlo congelado en el °C -20 el °C (prueba en el plazo de 1 mes) o -80 (probado en el plazo de 3 meses), evita ciclos hielo-deshielo repetidos.

2. La gama de la detección del equipo no es lo mismo que la gama de concentración de la muestra. Si la concentración de la sustancia de prueba en su muestra es más alta que el valor más alto del estándar, haga por favor un dilución múltiple apropiado antes de medir.

3. Si un extracto de la muestra o de la célula se prepara usando un lysate químico, la introducción de ciertas sustancias químicas puede causar desviaciones en medidas de ELISA.

6.Preparation antes de la prueba

1. Quite el equipo del refrigerador 20 minutos por adelantado y equilibre a la temperatura ambiente. Gire al lector del microplate 15 minutos por adelantado para calentar.

2. Preparación del diluyente

Diluído el dilución concentrado del estándar y de la muestra o el dilución concentrado del HRP-anticuerpo con el agua destilada doble (1:25).

3. Preparación del líquido de lavado

La solución que se lavaba concentrada fue diluida con el agua destilada doble (1:25).

Extremidad: La solución que se lava concentrada sacada del refrigerador puede tener cristales, que es un fenómeno normal. Puede ser calentada en un baño de agua de 40 °C para disolver totalmente los cristales y después para preparar la solución que se lava (la temperatura de calefacción no debe exceder 50 °C. La temperatura de la solución que se lava debe ser temperatura ambiente al usar). Utilícela por favor el mismo día.

4. Preparación estándar

Ponga el estándar en 1000 RPM para 1 minuto, añada 1,0 ml del diluyente del estándar y de la muestra al estándar liofilizado, apriete el casquillo del tubo, dejarlo por 10 minutos, y déle vuelta al revés varias veces. Después de que se disuelva completamente, la mezcla del uso suavemente con una pipeta (concentración de 16ng/de ml), y entonces realiza un dilución múltiple (nota: No realice directamente un dilución múltiple en la reacción bien). Se recomienda para formular las concentraciones siguientes: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0.25ng/ml. El dilución de la muestra fue utilizado directamente como pozo en blanco en 0 ng/ml.

Método doble del dilución

Tome 7 tubos del EP, añada el μL 500 del estándar y de la solución del dilución de la muestra a cada tubo, mida con una pipeta el μL 500 a partir de 16 ng/ml de la solución de trabajo estándar, añada al μL 500 del tubo y de la mezcla del EP del dilución de la muestra para hacer 8 ng/ml de la solución de trabajo estándar, siga este paso y entonces chúpelo y mézclese en orden. Como se muestra abajo.

Leyenda estándar del dilución (μL 500 como muestra)

Nota: El tubo pasado se utiliza directamente como agujero en blanco.

5.HRP etiquetó la preparación de la solución de funcionamiento del anticuerpo

Centrifugue el tubo del anticuerpo en de poca velocidad antes del experimento para evitar el anticuerpo residual en la pared del tubo y el casquillo del tubo. Calcule la cantidad requerida para el experimento (calculaba en 100 el μL /well) antes del experimento. En la preparación real, el μL 100-200 debe ser preparado. 15 minutos antes de usar, diluyen el anticuerpo HRP-etiquetado a la concentración de trabajo con el diluyente del anticuerpo (anticuerpo: diluyente = 1: 250) y utilizarlo el mismo día.

6.Preparation de la solución de funcionamiento que colorea (TMB)

Calcule la cantidad requerida para el experimento (calculaba en 100 el μL /well) antes del experimento. En la preparación real, el μL 100-200 debe ser preparado. 15 minutos antes de usar, diluyen el substrato cromogénico de TMB a la concentración de trabajo (substrato: diluyente = 1: 20) con el diluyente del substrato y utilizarlo el mismo día.

método 7.Cleaning

1. Lavadora automática de la placa: el μL 350 de la solución que se lava se añade a cada pozo, y los intervalos de la inyección y de la succión son 60 segundos.

2. Lave la placa a mano: Sacuda del líquido en el agujero, acaricíele seco en un papel absorbente grueso limpio (o el paño seco), añada el μL 350 de la solución que se lava a cada agujero (usted puede también utilizar una botella de lavado limpia para aclarar aquí), empape 2-3 minutos, chúpelos (no toque la pared del tablero) o sacudir apagado el líquido en el tablero y acariciar a seco en un papel absorbente grueso limpio.

procedimiento 8.Operating

1.Add la solución de trabajo del estándar a las primeras dos filas de pozos en orden, y añadir dos pozos de cada concentración del fluido operante de lado a lado, cada uno bien μL 100. La muestra que se probará se añade a otros pozos, μL 100 por bien. Si la concentración de la muestra es más alta que la gama de la detección, necesita ser diluida con el estándar y la solución del dilución de la muestra y añadió. Cubra el microplate e incube en el °C 37 por 60 minutos.

Nota: Al añadir la muestra, añada la muestra a la parte inferior de la placa de microtítulo sin el tacto de la pared del pozo, y sacuda suavemente para evitar burbujas de aire. Añada la muestra en el plazo de 10 minutos.

2.Washing: Deseche el líquido, seco de vuelta, y acaricie a seco en un papel absorbente grueso limpio. Añada el μL 350 de la solución que se lava a cada pozo y empápelo por 3 minutos. Aspire (no toque la pared de la placa) o sacudir apagado el líquido en la placa y acariciar a seco en un papel absorbente grueso limpio. Repita este paso que se lava 3 veces.

el μL 3.Add 100 de la solución de trabajo del HRP-anticuerpo a cada pozo, se mezcla bien, cubre la placa de microtítulo e incuba en el °C 37 por 30 minutos.

4.Washing: Lave la placa 4 veces con la solución del lavado, los pasos del método son lo mismo que 2.

el μL 5.Add 100 de la solución de funcionamiento del colorante del substrato (TMB) a cada pozo, cubre la placa de microtítulo e incuba en el °C 37 por 10 minutos.

Nota: Puede ser acortada o ser ampliada como apropiada según el desarrollo real del color, y el tiempo de desarrollo del color está dentro del radio de acción de 5-30 minutos. Cuando el estándar muestra bien una pendiente significativa, puede ser terminado.

μL 6.Add 50 de la solución de la parada a cada pozo para parar la reacción, y para dejarla en la temperatura ambiente para 1 minuto.

Nota: El orden de la adición de para la solución debe ser lo mismo que el de la solución del substrato. Cuando el adición líquido, no toca la extremidad de la pipeta para evitar la contaminación, que afectará a los resultados experimentales.

7.Use un lector del microplate para medir la densidad óptica (valor OD450/650 del nanómetro) de cada pozo en 450 nanómetro (longitud de onda 650nm de la referencia).

Nota: Accione por favor en el lector del microplate por adelantado, caliente el instrumento, y ponga el programa de la detección.

juicio 9.Result

1.Calculate el valor medio del OD de cada grupo de pozos. El valor medio del OD de cada estándar menos el valor del OD del pozo en blanco fue utilizado como el valor de corrección. Tome la concentración del estándar como la abscisa (x) y el valor del OD como la ordenada (y), dibuja una curva estándar (el valor del grupo en blanco se puede también quitar cuando trazado).

2.It se recomienda para utilizar la curva profesional que hace software (tal como experto 1,3 de la curva o ELISA Calc, etc.) para dibujar una curva estándar según los requisitos específicos del experimento.

3.If el valor del OD de la muestra es más alto que el límite superior de la curva estándar, él se debe remedir después del dilución apropiado.

datos 4.Typical

Debido a diversas condiciones de funcionamiento experimentales (tales como operador, midiendo con una pipeta tecnología, tecnología que se lava de la placa, y las condiciones estables, etc.), el valor del OD de la curva estándar puede ser diferente. El equipo de ensayo proporciona datos y curvas en el rango de 0.25-16 ng/ml para la referencia. El experimentador puede seleccionar puntos dentro de esta gama para establecer una curva estándar.

1)Línea estándar de la curva de la gama 0.25-16ng/mL de la medida

10.Precautions

1.Storage: Almacene por favor los reactivo en el equipo razonablemente según las instrucciones. Avoid que expone los reactivo a la luz fuerte durante almacenamiento y la incubación. Todas las botellas reactivas necesitan ser atornilladas firmemente para prevenir la evaporación y la contaminación microbiana, los resultados de otra manera falsos puede ocurrir.

Placa 2.ELISA: Puede haber un poco agua-como sustancia en el pozo de la placa de microtítulo apenas-abierta. Esto es normal y no afectará a los resultados experimentales. El listón se debe quitar y poner en un bolso ziplock de repuesto y almacenar en la temperatura recomendada si no es utilizado en futuro próximo.

muestra 3.Adding: Al añadir muestras y añadiendo el mismo reactivo, un intervalo de muestreo excesivamente largo entre el primer pozo y el pozo pasado dará lugar a diversos tiempos de la “preincubación”, que afectarán obviamente a la exactitud y a la repetibilidad de los valores medidos. Es mejor añadir muestras en el plazo de 10 minutos. Se recomienda la determinación de los agujeros duplicados.

4.Incubation: Para evitar que la muestra se evapore, la placa de microtítulo se debe cubrir durante el experimento. El paso siguiente debe ser realizado cuanto antes después de lavar la placa para evitar que la placa de microtítulo sea seca. Adherencia estricta al tiempo y a la temperatura dados de la incubación.

5.Washing: El líquido que se lava que permanece en los pozos de la reacción durante el proceso que se lava debe ser seco acariciado en el papel absorbente. No ponga el papel de filtro directamente en los pozos de la reacción para absorber el agua. Antes de la lectura, quite el líquido y las huellas dactilares residuales en la parte inferior del lector del microplate para evitar afectar a la lectura del lector del microplate.

preparación 6.Reagent: El líquido puede adherirse a la pared del tubo o a la cápsula durante el transporte, así que utilice 1000 RPM/el centro de separación para que un minuto deposite el líquido atado a la pared del tubo o a la cápsula a la parte inferior del tubo. Antes de usar, mida con una pipeta cuidadosamente 4-5 veces con una pipeta de mezclar la solución. Todos los reactivo se deben preparar exactamente como se indica en las instrucciones.

7.Control del tiempo de la representación de color: Después de añadir el substrato, observe por favor el cambio del color del agujero de la reacción regularmente (por ejemplo, cada cinco minutos). Si la pendiente es obvia, añada por favor la solución de la terminación por adelantado para parar la reacción, para evitar color demasiado profundo y afectar a la lectura del lector de la enzima.

8.Substrate: Guarde por favor el substrato lejos de la luz. Evite la exposición directa a la luz fuerte al almacenar y calentándose.

9.Mixing: La mezcla suficiente y leve es particularmente importante para los resultados de la reacción. Es mejor utilizar un oscilador micro con la frecuencia más baja. Si no hay oscilador micro, usted puede golpear ligeramente manualmente el marco de la placa de la etiqueta de la enzima para mezclarse antes de la reacción.

los lotes 10.Different de componentes del equipo no serán mezclados (excepto detergente y la solución de la terminación)

tarifa de recuperación de la muestra 11.About

1) Este equipo utiliza la determinación de la antigenicidad del enterokinase bovino recombinante en vez de su actividad para estimar el residuo de la proteína. Por lo tanto, el estándar en el equipo utiliza el coeficiente de extinción del enterokinase bovino recombinante (el E1% el 1cm = 20.01D, es decir, cuando A280nm = 2,01 en aquel momento, concentración bovina del enterokinase era 1mg/ml) para calcular su contenido proteínico, y el control de calidad interno fue utilizado para guardar el contenido estándar como exacto y constante como sea posible.

2) Los diversos métodos y diferencias de la medida en pureza del producto pueden llevar al contenido proteínico contrario del enterokinase bovino de diferentes fuentes y de diversos lotes de productos, y también a las diferencias de la causa en tarifas de recuperación. Para evitar la influencia de los factores antedichos, se recomienda para utilizar el método espectrofotométrico (A280nm) para estimar el contenido proteínico de la muestra usada para la prueba de recuperación, y después para diluirlo a una concentración conveniente para que la prueba de recuperación minimice el error de la recuperación.

análisis 11.Problem

Si hay problemas con los resultados experimentales, tome por favor las fotos de los resultados del desarrollo del color a tiempo, y almacene correctamente los listones y los reactivo inusitados, y entonces el soporte técnico del contacto. También refiera a la información abajo para descubrir por qué.