equipo Enzima-ligado del análisis del inmunosorbente (ELISA) para la tripsina recombinante

1. Uso previsto

Este equipo de ELISA se piensa para el uso en la cuantificación de la tripsina, recombinante del páncreas porcino. El equipo está para el uso de la investigación solamente y no se piensa para el uso de diagnóstico en ser humano o animales.

2. Principio del procedimiento

Este análisis de la tripsina es un análisis immunoenzymtric del dos-sitio. La tripsina recombinante del páncreas porcino, expresado en Escherichia Coli, de YAXINBIO, en las muestras se reacciona en los pozos del microtítulo cubiertos con un anticuerpo purificado de la captura. Un anticuerpo monoclonal de la anti-tripsina conjugado con la peroxidasa del rábano picante de la enzima (HRP) se reacciona que forma simultáneamente un complejo del bocadillo de la anticuerpo-tripsina-HRP de la fase sólida etiquetada anticuerpo. Después de un paso del lavado para quitar cualquier reactivo desatado, los pozos entonces se reaccionan con el substrato del tetramethylbenzidine (TMB). La cantidad de substrato hidrolizado se lee en un lector de la placa de microtítulo y será directamente proporcional a la concentración de tripsina recombinante presente en las muestras. La cuantificación exacta es alcanzada comparando la señal de los estándares recombinantes de la tripsina probó al mismo tiempo.

3. Los reactivo y los materiales proporcionaron

4. Materiales y equipo requeridos pero no proporcionados
5. Espectrofotómetro del lector de la placa de microtítulo con capacidad dual de la longitud de onda en 450 y 650 nanómetro. Si su lector de la placa no proporciona análisis dual de la longitud de onda, usted puede leer en apenas la longitud de onda de 450 nanómetro.
6. Pipettors – μL 50 μL y 100
7. Repetición o pipeta de varios canales – μL 100
8. Incubadora, 37°C
9. Cojín absorbente limpio

5. Precauciones
6. No se piensa para el uso de diagnóstico en ser humano o animales.
7. El reactivo de la parada es los 0.5M H₂ TAN₄. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. En las concentraciones usadas en este equipo, no se cree ningunos de los otros reactivo para ser dañinos.
8. Este equipo se debe utilizar solamente por los técnicos calificados.
6. Características de funcionamiento

YAXINBIO ha validado el análisis por criterios convencionales según lo indicado abajo.

1. Sensibilidad

El límite de la detección más bajo (LOD) se define como esa concentración correspondiente a desviaciones estándar de una señal dos sobre el medio del estándar cero. LOD es ~11 pg/mL en el protocolo recomendado. El límite más bajo de la cuantificación (LOQ) se define como la concentración más baja, donde están los coeficientes de la concentración de variación (CVs) <20>

2. Precisión

La precisión se define como el coeficiente del por ciento de variación (%CV). Esto es calculada dividiendo la desviación estándar por el valor medio para varias determinaciones replegadas de dos diversas muestras de control en la gama de concentración baja y alta del análisis. El intra-análisis y la precisión del inter-análisis fueron determinados en 2 piscinas con el punto bajo (~1,25 ng/mL) y las altas concentraciones (~10 ng/mL).

Intra-análisis

Inter-análisis

3. Especificidad/reactividad cruzada
4. Este equipo de ELISA se piensa para detectar la tripsina, recombinante del páncreas porcino. Se sugiere que la compatibilidad de la calibración del equipo esté conducida, si se utiliza para el otro tipo de tripsina.
5. Los materiales siguientes fueron probados para la reactividad cruzada en las concentraciones indicaron ambos en ausencia de la tripsina recombinante y en presencia de la tripsina recombinante de 5 ng/mL. No se encontró ningunos de estos materiales para rendir ningún aumento o disminución falso estadístico significativo de concentraciones recombinantes evidentes de la tripsina. Se recomienda que los materiales sabidos de cada prueba de usuario en sus matrices de la muestra para la reactividad cruzada en un experimento similar, cuando es necesario.

7. Materiales no cruzar reactivo para la tripsina recombinante

1. Limitaciones

La tripsina de otros proveedores con excepción de YAXINBIO puede mostrar una diversa reactividad con respecto a sensibilidad y a exactitud. Por lo tanto la compatibilidad de la calibración del equipo al producto individual de la tripsina debe ser verificada.

2. Interferencia de matriz

Aunque el análisis se diseñe para minimizar interferencia de matriz, ciertas matrices de la muestra pueden interferir en este análisis. Los materiales, tales como detergentes y sal en la alta concentración, los extremos de pH (<6>8,5) o las concentraciones muy de alto valor proteico pueden dar resultados erróneos. Se recomienda para probar la matriz de la muestra para interferencia diluyendo el estándar de 10 ng/mL para analizar la recuperación.

3. Capacidad de gancho

El efecto del gancho de la alta dosis se puede observar en muestras

con concentraciones muy altas de tripsina recombinante. Las lecturas de las muestras mayores de 10 ng/mL (80ng, 100ng, 500ug, 1mg/mL) pueden dar absorbencias menos que el estándar 40ng/mL. Se recomienda altamente que las muestras deben ser probadas por diluido, cuando sus lecturas eran ≧10 ng/ml.

8. Control de calidad

La precisión en muestras duplicados debe rendir los coeficientes de variación medios de menos el de 10% para las muestras mayor de 1 ng/mL. CVs para las muestras <1 ng="">

9. Tiempo del análisis

Tiempo de la incubación: 1 minuto de h 45 a 2 horas

Tiempo total del análisis: aproximadamente 2 a 2,5 horas

10. Notas para las muestras
11. Las muestras se deben probar en el plazo de 7 días, cuando están almacenadas en 4°C, o divididas y almacenadas en -20°C (mes ≤1) o -80°C (meses ≤3). Avoid repitió ciclos hielo-deshielo.
12. Los supernatants, centrifugados de muestras del cultivo celular se pueden utilizar para la determinación de la tripsina.
13. Se recomienda para probar la matriz de la muestra para interferencia, cuando es necesario.
14. Se recomienda para diluir las muestras (e.g., 1:20 al 1:100) con diluyentes de la muestra, qué concentración de la tripsina de approximately>10 ng/ml se esperan en las muestras
15. Evite el análisis de las muestras que contienen el azoturo del sodio (NaN₃), que destruirá la actividad de HRP de la conjugación y podría dar lugar a lecturas más bajas.

11. Notas procesales
12. Todos los estándares, controles y muestras se deben probar dos veces. Mantenga una secuencia que mide el tiempo repetidor de bien para manar para que todos los pasos del análisis aseguren que todas las veces de la incubación son lo mismo para cada uno bien.
13. Totalmente el lavarse de las placas para quitar exceso
14. los reactivo unreacted son esenciales para la buenas reproductibilidad y sensibilidad del análisis. El procedimiento manual del lavado descrito más abajo proporciona generalmente fondos más bajos, una absorción específica más alta, y una mejor precisión. Si el duplicado CVs es pobre, o si la absorción de los 0 estándares de ng/mL es mayor de 0,200, evalúe la procedura de la placa para el funcionamiento apropiado.
15. Si el substrato tiene un color azul distinto antes de análisis, pudo haber sido contaminado. Si la absorción del μL 100 del substrato más el μL 100 de la solución de la parada contra un espacio en blanco del agua es mayor de 0,1, puede ser necesario obtener el nuevo substrato o la sensibilidad del análisis puede ser comprometida. Las tiras se deben leer en el plazo de 30 minutos después de añadir paran la solución, puesto que el color se descolorará en un cierto plazo.
16. No mezcle ni utilice los componentes de otras porciones (a excepción de soluciones del almacenador intermediario que se lavan y de la parada).

12. Preparación de reactivo

Traiga todos los reactivo a la temperatura ambiente.

1. Diluyentes de trabajo para el estándar, las muestras y HRP-Ab (P1)

Con desionizado o el agua destilada en un coeficiente de 1:25, trae diluyentes concentra (P1, 25×) para el estándar, las muestras y el HRP-Ab a los diluyentes de trabajo.

2. Almacenador intermediario del lavado (P2)

Concentrado diluído del lavado (P2, 25×) con desionizado o agua destilada en proporción a 1:25 para hacer el almacenador intermediario de trabajo del lavado. Si los cristales han formado en el concentrado, caliéntelo en el baño de agua 40°C y mezclarlo suavemente, hasta que los cristales hayan disuelto totalmente.

3. Solución de funcionamiento para la curva estándar.
4. Brevemente la centrifugadora (1,000×g para 1 minuto) los lyophilizates estándar de la tripsina y lo reconstituyó cuidadosamente con 1ml. La concentración final de la reconstitución es 10 ng/mL.
5. Dilución de duplicación
6. Liquate P1 a siete tubos del EP, μL 500 de cada uno.
7. Mida con una pipeta el μL 500 de la solución de 10 ng/mL al primer tubo y mézclese para arriba para producir una solución de funcionamiento de 5 ng/mL. Solución del μL de la pipeta 500 del tubo anterior el último en orden, hacer por consiguiente 0,63, 0,312, 0,156 y 0 ng/ml serial de las concentraciones (10,5,2.5, 1,25,) como solución de funcionamiento para la curva estándar. Sea consciente que no mide con una pipeta la solución del tubo anterior al tubo pasado, pues se mira como control en blanco.
4. Solución de funcionamiento para la conjugación del anticuerpo-HRP (A2)

Diluya la conjugación concentrada de HRP (A2,250×) en una proporción de 1:250 con P1. De acuerdo con la cantidad requerida (100 μL/well), la cantidad adicional del μL 100~200 se recomienda.

5. Substrato de TMB (A3)

Substrato diluído de TMB (A3, 20×) con P3 en un coeficiente del 1:20 para hacer una solución de trabajo (A3).

13. Protocolo del análisis
14. Mida con una pipeta el μL 100 de estándares, de controles y de muestras en la parte inferior de pozos y evitar tocar la pared interior y hacer espuma como sea posible. Cubra el microplate con el sellador de la placa. Entonces incube en 37°C para 60minuts.
15. Aspire o decante la solución de cada pozo. Los pozos del terraplén a desbordar con la solución diluida del lavado usando arrojan a chorros abundante la botella o midiendo con una pipeta el μL in~350. Empape por 1~2 minutos y aspire o decante la solución y acariciarle.

Seqúese contra el papel absorbente limpio. Repita este paso del lavado 3 veces.

Nota:

• Una lavadora del microplate se puede utilizar en este paso y otros pasos del lavado.
• Mancha blanca /negra y golpear ligeramente suavemente pero firmemente sobre el papel absorbente para quitar la mayor parte del líquido residual. No es necesario en un intento por quitar todo el líquido residual y puede causar la disociación variable del material del límite del anticuerpo dando por resultado un ODs más bajo y la precisión peor.
• Pipeta 100μL del rTrypsin-HRP anti (A2) en cada pozo. Cubra y incube 37°C por 30 minutos
• Contenido de la descarga de pozos. Repetición para un total de 5 lavados con el almacenador intermediario del lavado (P1). Limpie de cualquier líquido del exterior de la parte inferior de los pozos del microtítulo, como cualquier residuo puede interferir en el paso de la lectura. No permita que los pozos se sequen antes de añadir el substrato.
• Mida con una pipeta el μL 100 del substrato de TMB (A3).
• Incube en la temperatura ambiente por 10-30 minutos. NO SACUDA.
• Mida con una pipeta el μL 50 de la solución de la parada (P4) a cada pozo.
• Absorción leída en 450/650 nanómetro.

14. Cálculo de resultados
15. Haga un promedio de las lecturas duplicados para cada estándar y las muestras, después reste la densidad óptica estándar cero media.
16. Los estándares se pueden utilizar para construir una curva estándar con los valores divulgados en ng/mL. Esta reducción de datos se puede realizar con métodos del ordenador usando rutinas de la curva-colocación, tales como ajuste logístico de 4 parámetros o ajuste logístico de 5 parámetros. ¡No utilice el análisis de regresión linear para interpolar los valores para las muestras como esto puede llevar a las inexactitudes significativas!
17. Las absorciones de muestras entonces se interpolan de la curva estándar. Si se han diluido las muestras, la concentración calculada de la curva estándar se debe multiplicar por el factor del dilución. Si el OD de la muestra supera el límite superior de la curva estándar, usted debe reexaminarla, después del dilución apropiado.
18. Los datos típicos como los valores del OD de la curva estándar pueden variar, según las condiciones del funcionamiento real del análisis (e.g operador, midiendo con una pipeta técnica, técnica que se lava o efectos de temperatura), el operador deben establecer la curva estándar para cada prueba.
19. La curva estándar típica y los datos abajo se proporciona para la referencia solamente.

Datos experimentales